多重抗病毒层析技术在产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌快速鉴定中的价值

KPC新标准型化合物青霉烯蛋白酶却无法[5, 6]。因此，在药理学诊疗实习中的相当有确实对蛋白酶新标准型同步进行说明区分。

目前，药理学微生命体检测室主要在用的化合物青霉烯青霉素霉菌监测归纳方依此最主要同上新标准型监测归纳方依此、大分子监测归纳方依此及HIV包被监测关键技术等，不尽相同的监测归纳方依此各别压倒性，也有一定技术的发展局限性。根据监测内中生虫对化合物青霉烯青霉素的分解活性为理论的同上新标准型病症归纳方依此有基质飞行质谱关键技术（MALDI-TOF MS）[7, 8]、生化重排次检测（如Carba-NP次检测及其改良的归纳方依此）[9, 10]、化合物青霉烯类灭活检测（carbapenem inactivation method，CIM次检测）[11]和OXA-48纸片次检测[12, 13]等；此皆，有样本归纳者探索性地证明了其他在药理学上较最常技术的发展的同上新标准型同上明归纳方依此的农业效益性，但是缺点是耗时长，所需要24两星期没完成，这些归纳方依此亦不可监测显露说明的化合物青霉烯蛋白酶新标准型别[13, 14]。除同上新标准型监测归纳方依此皆，大分子病症归纳方依此或许补救了这一情况，如往北PCR和动态荧光定量PCR。通过单通道或多通道PCR扩增做到对多种化合物青霉烯蛋白酶基因新标准型的实际上监测，具备极低的增益及免疫的压倒性[15-17]；然而这些归纳方依此价钱昂贵，而且所需要上佳的管理学关键技术才能获得有效率的结果，相当适合全球性所有的药理学微生命体检测室。免疫细胞层析依此（lateral flow immunoassay，LFIA）是一种通过将不尽相同新标准型别的化合物青霉烯蛋白酶HIV包被于固态基质上、根据蛋白-HIV结合的理论做到对CPE及说明化合物青霉烯蛋白酶蛋白酶新标准型的监测归纳方依此[18-22]。LFIA依此不可同时监测五种主要化合物青霉烯蛋白酶，但具备短一段时间——在15分钟内没完成对纯病霉菌的实际上监测，且100%增益和免疫的显著压倒性。

根据目前的CPE青霉素现状及药理学需要求，化合物青霉烯青霉素霉菌的青霉素性监测归纳方依此应当同时具备价钱便宜（极低的耗材和设备费用）和较易使用（极低的关键技术重复性）两方面的优点。因此，本样本归纳技术开发了一种基于LFIA理论的皂品——Carba5。该次检测监测五种主要的化合物青霉烯蛋白酶远亲，最主要NDM、IMP、VIM、KPC以及OXA-48-like新标准型。Carba5具备以下特点：小巧、比较稳定（在须要冷藏的上述前提可比较稳定超过24个年初）、较好的Gmail体会（只用部门须要特殊专业训练）和优良的监测效率（高增益和免疫）；相比于每个检测费用30~40卢比的大分子归纳方依此，Carba5具备费用低廉的压倒性（虽然尚没指明价钱，但左右似于的LFIA检测通常每个费用为10卢比）[20]。更极为重要的是，Carba5在不所需要高新关键技术设备的上述前提，可以在短一段时间内得不到监测结果。本样本归纳设为了296株肠杆霉菌一个科内中生虫，这些霉菌来自于阿尔及利亚国立霉菌种馆藏中的心（Associated French National Reference Centre，F-NRC），其中的180株为已知皂β-嘌呤蛋白酶的霉菌种、116株为化合物青霉烯青霉素霉菌。通过Carba5对面板培训病霉菌同步进行实际上监测，我们剔除了185株霉菌同上达NDM、IMP、VIM、KPC或OXA-48-like新标准型化合物青霉烯蛋白酶，并且所有的监测结果仅于15分钟内没完成。

一

样本归纳归纳方依此

1.外一个科方：本样本归纳中的所有检测仅符合阿尔及利亚和欧洲生物检测新标准（European Community Directive 86/609，French Law 2001-486，6 Jun 2001）及外一个科方新标准。

2.受试霉菌种：本样本归纳中的有180株霉菌种为回顾性霉菌种，现在利用PCR同上明过皂β-嘌呤蛋白酶：55株非化合物青霉烯蛋白酶皂蛋白酶霉菌种和125株皂化合物青霉烯蛋白酶霉菌种。125株皂化合物青霉烯蛋白酶霉菌种中的30株霉菌皂的是A类化合物青霉烯蛋白酶（KPC新标准型22株、IMI新标准型3株、SME新标准型2株、NMC-A新标准型1株、FRI-1新标准型1株和GES-5新标准型1株）、52株霉菌皂B类钛-β-嘌呤蛋白酶（NDM新标准型23株、VIM新标准型17株、IMP新标准型11株和GIM-1新标准型1株）、38株霉菌为D类蛋白酶；还有5株霉菌种同时同上达NDM新标准型和OXA-48-like新标准型化合物青霉烯蛋白酶。D类蛋白酶中的37株仅为OXA-48-like新标准型（OXA-48新标准型21株，OXA-162新标准型1株，OXA-181新标准型3株、OXA-204新标准型5株、OXA-232新标准型2株、OXA-244新标准型2株、OXA-517新标准型1株、OXA-519新标准型1株和OXA-535新标准型1株）和1株为OXA-372新标准型。我们利用Carba5对这些已知青霉素机制的内中生虫同步进行化合物青霉烯蛋白酶监测。

在革命性审核检测中的，设为了至少对一种化合物青霉烯类杀霉菌用药敏感性增高的肠杆霉菌一个科内中生虫116株。这些霉菌种是由阿尔及利亚各个药理学微生命体学检测室于2017年4年初至5年初间剥离、并内中到F-NRC的。

3.化合物青霉烯蛋白蛋白酶精确测量及PCR/PCR检测：分别用改良Carba-NP次检测、PCRPCR归纳方依此监测上述受试肠杆霉菌一个科内中生虫的化合物青霉烯蛋白蛋白酶[10]。

4.基因工程氢化：重新组建同上达NDM-1（G29-R270）、OXA-48（K23-P265）、KPC-2（A30-Q293）、IMP-1（L22-N246）和VIM-1（A22-E266）等五种化合物青霉烯蛋白酶，去除其C端his关键字。分别以此五种化合物青霉烯蛋白酶免疫细胞10周龄Biozzi小鼠、审核显露受限制于免疫细胞层析依此的基因工程[19]。

5.Carba5次检测提案：根据手抄本媒体报道的归纳方依此，由NG Biotech母公司生皂用于多重免疫细胞层析依此的贝克曼HIV（却说图1）[19]。首先将待检霉菌裹在Uriselec-TM 4或MH琼脂面板上，于37℃条件下过夜培训。第二天使用接种环挑取单克隆病霉菌，混悬在150μL提炼缓冲液中的同步进行甘油，随后吸取100μL混悬液加样在Carba5卡条的“S”孔中的，室温下重排15分钟。商业性的监检测剂盒的只用流程于此流程一致。

6. 样本借助：借助样本分两种归纳方依此：（1）通过看不见实际上驱动器结果。无症状交叉左右似于塑料监测板条上的新标准型别为何种即为何种化合物青霉烯蛋白酶新标准型别。（2）通过计算机辅助读片及实际上驱动器。可能的监测结果及理解却说图2。

7. 统计归纳：监测增益、免疫、无症状总共值和有性总共值利用统计软件vassarStats（）的95%CI值计算。检测金新标准为PCR及PCR，本样本归纳结果实际上推送到2012年至2015年全球性阿尔及利亚系统性样本库。

二

样本归纳结果

在技术的发展Carba5监测在此之后，对于180株F-NRC的回顾性霉菌种，我们现在利用单HIV免疫细胞层析依此对四种NDM、IMP、VIM及OXA-48-like新标准型化合物青霉烯蛋白酶分别同步进行了监测（结果没展示）[19]。同期，我们也对F-NRC中的心借助的60株皂KPC化合物青霉烯蛋白酶霉菌种同步进行了监测。这两部分结果仅与参比归纳方依此PCR及PCR同步进行来得，免疫细胞层析依此的增益及免疫仅高达100%。Carba5就是在此样本归纳新转变大大的的，可被技术的发展于药理学基本上监测，精确测量对于至少一种化合物青霉烯青霉素青霉素内中生虫的化合物青霉烯蛋白酶蛋白酶新标准型。

1.Carba5对回顾性样本归纳霉菌种的检测结果：Carba5对于所有皂OXA-48-like蛋白酶、KPC蛋白酶、NDM蛋白酶、IMP蛋白酶和VIM蛋白酶霉菌种仅具备极低的增益（爆冷信号）。皂OXA-48-like蛋白酶霉菌种共监测显露37株，经PCR及PCR考虑到的说明新标准型别及霉菌种总共分列OXA-48（n=21）、OXA-162（n=1）、OXA-181（n=3）、OXA-204（n=5）、OXA-232（n=2）、OXA-244（n=2）、OXA-517（n=1）、OXA-519（n=1）和OXA-535（n=1）。皂KPC蛋白酶霉菌种共计22株，分列KPC-2蛋白酶（n=19）和KPC-3蛋白酶（n=3）；皂NDM蛋白酶霉菌种共计23株，分列NDM-1蛋白酶16株、NDM-4（n=2）、NDM-5（n=1）、NDM-6（n=1）、NDM-7（n=1）和NDM-9（n=2）；IMP 蛋白酶共计1 1 株， 分别是IMP-1（ n = 5 ） 、IMP-8（n=5）和IMP-11（n=1）；皂VIM蛋白酶17株，VIM-1（n=12）、VIM-2（n=2）、VIM-4（n=2）和VIM-19（n=1）。此部分结果却说多余同上格S1。此皆有5株同时同上达NDM-1和OXA-181蛋白酶，结果显示两条无症状监测线。不皂化合物青霉烯蛋白酶霉菌种、单皂化合物青霉烯蛋白酶霉菌种及皂多个化合物青霉烯蛋白酶霉菌种的结果如图3附出处。

结果中的断定有3株皂OXA-48-like蛋白酶霉菌种具备相当弱的化合物青霉烯蛋白蛋白酶，这三株霉菌分列OXA-163（n=2）和OXA-405（n=1），虽然此时Carba5结果也呈无症状，但是应被判定为；也无症状。所有皂非Carba5靶向蛋白酶的CPE霉菌种，其Carba5监测结果仅为有性。这些霉菌的化合物青霉烯蛋白酶新标准型最主要8个A类蛋白酶：IMI（n=3）、GES-5（n=1）、NMC-A（n=1）、SME（n=2）和FRI-1（n=1），以及1个D类蛋白酶OXA-372（这是一种不统称OXA-48远亲的D类蛋白酶）[23]和1个B类蛋白酶GIM-1。另皆，51个不皂化合物青霉烯蛋白酶的霉菌种Carba5也没监测到无症状信号。

2. Carba5对革命性样本归纳霉菌的赞誉：在本样本归纳中的，我们设为了116株剥离株全面同步进行双盲来得归纳，同时利用三种归纳方依此对这批内中生虫同步进行监测，最主要Carba5免疫细胞层析依此、Carba-NP次检测及PCRPCR；以PCRPCR结果为参比归纳方依此，来得前两种归纳方依此的监测农业效益及优劣势。结果显示，在不到15分钟的一段时间内，Carba5免疫细胞层析依此没完成了70株化合物青霉烯蛋白酶无症状霉菌种的监测（同上1），分别左右似于的化合物青霉烯蛋白酶新标准型别为OXA-48-like新标准型57株[OXA-48（n=52）、OXA-181（n=3）和OXA-244（n=2）]、NDM新标准型9株[NDM-1（n=5）、NDM-5（n=3）和NDM-9（n=1）]、VIM新标准型2株[VIM-1（n=1）和VIM-4（n=1）]和KPC-3新标准型一株；此皆监测到一株NDM和OXA-48（NDM-5和OXA-48）双无症状霉菌种；其他46个剥离株的监测结果为有性。Carba-NP次检测耗时2两星期，45株霉菌得不到左右似于有性结果。PCRPCR结果显示有71株皂化合物青霉烯蛋白酶霉菌种，其中的70株与Carba5和Carba NP次检测结果一致，1株皂IMI蛋白酶阴沟肠杆霉菌（一种非靶向化合物青霉烯蛋白酶）仅Carba NP次检测呈无症状；45例不皂化合物青霉烯蛋白酶霉菌种经PCR监测为有性。

3. Carba5效率综合赞誉：Carba5免疫细胞层析依此对5种贝克曼蛋白酶监测的增益和免疫分别达致100%（95% CI=95.8%-100%）和95.3%（95% CI=86.0%-98.8%）（2株OXA-163和1株OXA-405霉菌种被所致为无症状）。本次检测很难监测同时同上达两种化合物青霉烯蛋白酶的霉菌种（如同时皂NDM新标准型和OXA-48-like蛋白酶的6株霉菌仅被监测显露来），极为重要的是没通过观察到与非贝克曼化合物青霉烯蛋白酶（如IMI、SME、NMC-A、FRI、GES、GIM和OXA-372蛋白酶）、ESBLs蛋白酶（如TEM、SHV和CTX-M）、AmpCs蛋白酶（CMY-2、DHA-2和ACC-1）或苯唑大白蛋白酶（OXA-1、-2、-9和-10）等的交叉重排。在革命性样本归纳中的，Carba5的增益达致100%（95% CI=93.5%-100%），免疫为100%（95% CI=90.4%-100%），无症状总共值为100%（95% CI=93.5%-100%），有性总共值为100%（95% CI=90.4%-100%）。两种不尽相同的面板（Mueller-Hinton/UriselecTM 4）对结果亦没皂生干扰。

三

探讨与归纳

皂化合物青霉烯蛋白酶肠杆霉菌一个科内中生虫的流行播散已带进一个极为重要的公共卫生弊端。从内中生虫感染依靠的角度来看，短一段时间鉴定这类霉菌种对于尽量减少其院内传播方式至关极为重要；此皆，对于新新标准型类似物/β-嘌呤类复合杀霉菌用药的技术的发展，借助说明化合物青霉烯蛋白酶新标准型别是应该使用这些制剂的先决件。因此，对于CPE霉菌种的化合物青霉烯蛋白酶新标准型别同步进行鉴定，转变便捷、短一段时间、有效率的监测归纳方依此相当确实，Carba5免疫细胞层析依此正符合这一建议、受限制所有内涵患者的需要求。

Carba5可以监测最主要KPC、NDM、VIM、IMP以及OXA-48-like新标准型在内的多种化合物青霉烯蛋白酶，并且大多总共上述前提，能在15分钟内没完成监测。与单次次检测的LFIAs相比，Carba5在五种化合物青霉烯蛋白酶间无交叉重排；对于同时皂多个蛋白酶新标准型时，Carba5也能有效率剔除。Carba5监测这五种化合物青霉烯蛋白酶的增益为100%，无法；也有性。此皆，它还能监测OXA-48-like蛋白酶新的突变，如OXA-517、OXA-519和OXA-535[24-26]。我们亦断定Carba5能监测显露一些无法轻微化合物青霉烯蛋白蛋白酶的突变，如OXA-163和OXA-405；对于这些蛋白酶的说明功能性即便如此所需要全面检测的论据。

对于这些特殊的OXA蛋白酶突变，本样本归纳中的从180株霉菌种中的断定了3株，这个比例或许有被夸大的更进一步，因为在阿尔及利亚左右4年剥离到的10000株霉菌种中的仅1株霉菌为此种上述情况。因此，结合阿尔及利亚系统性追查的样本，我们认为Carba5监测的免疫即便如此达致99.98%（95% CI=99.90%-99.99%）。

本样本归纳在对革命性样本归纳的霉菌种同步进行审核时，71株皂蛋白酶株中的Carba5监测显露了70株（98.6%），没断定IMI新标准型化合物青霉烯蛋白酶。考虑到IMI化合物青霉烯蛋白酶在CPE中的的随身携带率很低，这不应被认作一个皂品情况。

在2012年至2015年间，F-NRC中的心共计接到了9518株肠杆霉菌一个科内中生虫，其中的3320株为皂化合物青霉烯蛋白酶CPE霉菌种。在这些CPE霉菌种中的，有部分霉菌种现在指明了说明的化合物青霉烯蛋白酶新标准型别，最主要118株KPC、13株IMI、1株FRI-1、366株NDM、115株VIM、10株IMP、2491株OXA-48、120株OXA-181、35株OXA-204、8株OXA-232、10株OXA-244及33株多重皂蛋白酶霉菌种最主要30株NDM+OXA-48-like、1株NDM+VIM和2株VIM+OXA-48-like等。根据LFIA的监测结果，我们认为除了个别皂IMI以及皂FRI-1（共计14株）蛋白酶的霉菌种，以及检测中的唯一一株皂OXA-405蛋白酶粘质沙雷霉菌，其余所有霉菌种在技术的发展Carba5监测时都能得不到有效率的鉴定结果。总体来说，Carba5对5种主要化合物青霉烯蛋白酶监测的增益和免疫分列100%（95% CI=99.86%-100%）和99.98%（95% CI=99.90%-99.99%），无症状及有性总共值分列99.97%（95% CI=99.80%-99.99%）和100%（95% CI=99.92%-100%）。若将14株随身携带非贝克曼蛋白酶的CPE霉菌种的监测结果定义为；也有性结果的话，Carba5对于所有CPE霉菌种监测的增益及特异度分列99.58%（95% CI=99.27%-99.76%）和99.98%（95% CI=99.90%-99.99%），无症状及有性总共值分列99.97% (95% CI=99.80%-99.99%) 和99.77%（95% CI=99.61%-99.87%）。

到迄今，Carba5可以监测同一蛋白酶新标准型的不尽相同亚新标准型化合物青霉烯蛋白酶， 如NDM-1/4/5/6/7/9、IMP-1/8/11、VIM-1/2/4/19、KPC-2/3和OXA-48/162/181/204/232/244/517/519/535等亚新标准型仅能得不到无症状监测结果；其次，Carba5压倒性是可在基本上检测室同步进行监测，并于15分钟没完成。另皆，只要霉菌种有同上达的贝克曼蛋白酶，就能被监测显露来，从而理解其对于化合物青霉烯青霉感性增高。我们也断定Carba NP次检测在监测皂NDM新标准型蛋白酶的普罗维登霉菌属霉菌种时平常为有性的监测结果，这些；也有性的Carba NP次检测结果可能是由于化合物青霉烯蛋白酶的同上达总体极低或内中生虫糖蛋白的免疫增高等情况；然而，对于这些霉菌Carba5能有效率监测。此皆，我们也断定不尽相同面板对监测结果无法影响，如技术的发展Carba5监测CPE审核面板（如Carba-SMART）[27]上的单克隆培训霉菌相当影响监测结果，这指显露Carba5是一种有效率的归纳方依此。

与其他LFIA归纳方依此相比，Carba5针对目前流行最广的五种化合物青霉烯蛋白酶。它的市场推广将有助于立即种系统CRE的爆发及地区性流行。虽然化合物青霉烯蛋白酶新标准型别在不尽相同发展中国家不尽相同范围内之间不存在区别，但这五种主要的化合物青霉烯蛋白酶在每个发展中国家占比都能超过99.5%，仅仅相比比例的差异，我们的归纳方依此受限制于大多总共的上述情况。为了证明这种归纳方依此的有效率性及技术的发展农业效益，以多中的心的形式同步进行更大的规模检测即便如此相当确实。目前，在某些OXA-48、KPC和MBLs高发发展中国家，现在有药理学检测检测在做了。

我们期望在不久的将来能将Carba5与CTX-M新标准型蛋白酶的LFIA共同监测，这样就能借助更曾三度的β-嘌呤蛋白酶监测手段，也能为药理学制剂的使用借助更多的检测室论据。

四

样本归纳论点

在药理学微生命体检测室，Carba5是一种较易在基本上实习中的开展，能高效、短一段时间监测CPE的归纳方依此。它是现有化合物青霉烯蛋白酶监测次检测的齐备和多余，特别是在水资源有限和/或化合物青霉烯蛋白酶肠杆霉菌一个科内中生虫高发的发展中国家。短一段时间、有效率鉴定OXA-48-like和KPC新标准型化合物青霉烯蛋白酶可以为药理学使用头孢他啶/尼古拉斯苏达借助论据，不仅助于防范制剂的滥用，更能有效防范这些致命青霉素内中生虫在的医院环境中的的播散。

致谢：我们感激QuentinBaratte为我们借助所需要基因工程。

基金来源：本项目经费取自the Assistance Publique—Hoˆpitaux de Paris (AP-HP), the University Paris-Sud, the Laboratory of Excellence in Research on Medication and Innovative Therapeutics (LERMIT) 、the French National Research Agency (ANR-10-LABX-33) 及the Joint Programming Initiative on Antimicrobial Resistance (JPIAMR) DesInMBL (ANR-14-JAMR-002).

透明度声明：L.D.是CarbaNP检测的协力技术开发者，该检测的专利统称生命体金雳埃母公司 (La Balmes les Grottes, France)。所有写作者：须要声明。

多余样本：同上S1却说JAC Online的多余样本。

出处：本文取自《药理学检测室》杂志2020年第10期“内中生虫感染性疾病”研讨

-End-

题图 | veer.com

原文面世一段时间 | 2020年11年初4日

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